DHFR CRISPR/Cas9 KO质粒 (h2): sc-417022-KO-2
- 针对种属：human
- 20 µg 纯化的即用型的质粒DNA，最多可供20次转染
- DHFR CRISPR/Cas9 基因敲除（KO）质粒（h2） 是一组质粒混合物，每种质粒均编码 Cas9 核酸酶及针对特定靶点的 20 核苷酸引导 RNA（gRNA），其设计基于 GeCKO v2 文库中的序列，旨在实现最高的基因敲除效率
- gRNA序列引导Cas9在DHFR基因组位点诱导位点特异性双链断裂（DSBs），从而通过非同源末端连接（NHEJ）实现基因敲除
- 建议将 DHFR HDR 质粒 (h2) (sc-417022-HDR-2) 与 DHFR CRISPR/Cas9 KO 质粒 (h2) 共同转染，通过 HDR 介导的嘌呤霉素抗性 cassete 和 RFP 报告基因整合，实现对成功编辑细胞的筛选
- DHFR HDR质粒（h2）是一组质粒混合物，其中每条质粒均含有一个同源导向修复（HDR）模板，对应于DHFR CRISPR/Cas9 KO质粒（h2）中的gRNA靶位点
- 每个HDR质粒包含两个约800 bp的同源臂，分别位于嘌呤霉素抗性基因和RFP基因片段的两侧，其设计目的是结合Cas9诱导的双链断裂位点周围的基因组DNA序列，从而促进精确的HDR介导整合
- 嘌呤霉素抗性基因和 RFP 基因两侧有 LoxP 位点，因此在建立稳定的基因敲除细胞系后，可以通过 Cre 重组酶（Cre 向量：sc-418923）去除选择标记。
- 转染后，基因敲除效率可以用抗体：DHFR: sc-74594，通过WB, IF或者IHC分析
订购信息
| 产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格 | 数量 | 收藏夹 | |
DHFR CRISPR/Cas9 KO质粒 (h2) | sc-417022-KO-2 | 20 µg | CNY2986.00 | |||
DHFR HDR 质粒 (h2) | sc-417022-HDR-2 | 20 µg | CNY3347.00 |
概述
二氢叶酸还原酶（DHFR）是一种细胞质酶，催化在 NADPH 依赖下将二氢叶酸还原为四氢叶酸，从而维持从头合成胸苷酸和嘌呤所需的一碳代谢。通过这一活性，DHFR 支持 DNA 复制与修复，将叶酸代谢与核苷酸库的平衡联系起来，并影响依赖 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的甲基化能力。DHFR 的功能与增殖调控及细胞对复制应激的反应密切相关，在肿瘤细胞生物学和抗叶酸药物敏感性方面具有广泛意义。在多种肿瘤背景中，叶酸代谢失调以及 DHFR 表达或拷贝数的改变，均与生长表型变化及药物反应机制相关。
DHFR CRISPR/Cas9 敲除质粒（h2）是一组质粒池，旨在针对性地破坏human细胞系中的DHFR基因。该文库中的每个质粒均共表达一种独特的sgRNA，针对DHFR基因座内的不同位点，同时表达来自化脓性链球菌的Cas9核酸酶，并编码GFP以实现对成功转染细胞的荧光识别和富集。这种多引导策略提高了诱导产生功能性敲除的移码突变或缺失的概率，为单引导策略提供了更可靠的替代方案。在多个位点诱导的双链断裂（DSBs）可通过非同源末端连接（NHEJ）修复，或者当与随附的HDR供体模板配合使用时，可在基因座内的特定靶位点通过同源导向修复（HDR）进行修复。
若与表达 RFP 的 HDR 供体结合使用，可同时利用 GFP 和 RFP 荧光区分转染细胞群与编辑后的细胞群，从而简化基于流式细胞术的分选和克隆筛选工作流程。
同源导向修复 (HDR) 供体 — 含 RFP 报告基因的嘌呤霉素抗性 cassete
对于需要确认且可筛选的敲除克隆的应用，DHFR HDR质粒（h2）包含一个HDR供体构建体，其中含有嘧啶霉素抗性盒（PuroR）和红色荧光蛋白（RFP）报告基因，两侧由针对特定DHFR靶位点的同源臂包围。
与 DHFR CRISPR/Cas9 敲除质粒（h2）共转染时：
- PuroR-RFP 片段通过同源重组（HDR）整合到 Cas9 切割位点，从而破坏 DHFR 的开放阅读框。
RFP 荧光可作为整合成功的即时视觉指示，支持在嘌呤霉素筛选之前或同时，基于荧光对编辑后的细胞进行鉴定或分选。
通过嘌呤霉素抗性可确认编辑成功的细胞，从而大幅减轻克隆筛选的工作量。
该筛选策略非常适合构建稳定的克隆性敲除细胞系，用于下游的功能研究、药物筛选或模型开发。
Cre-lox 盒去除系统
HDR 供体构建体的loxP 位点位于 PuroR-RFP 选择盒的侧翼，可在克隆确认后干净利落地去除标记。通过随附的Cre 载体：sc-418923，瞬时表达 Cre 重组酶，切除基因盒，在DHFR 基因座内留下最小的残留 loxP 位点，消除对下游检测的潜在干扰效应。
这种两步法
- 最大限度减少对局部染色质结构及邻近调控元件的干扰
在编辑位点恢复近乎天然的基因组环境
支持在同一细胞系中重复使用嘌呤霉素筛选策略进行后续编辑
主要特点
- gRNA靶向对DHFR功能至关重要的DHFR外显子
SpCas9与sgRNA由单一质粒共表达，简化递送流程
含嘌呤霉素抗性的HDR供体，便于阳性克隆筛选
由Cre重组酶载体携带的loxP夹杂PuroR盒，实现无缝标记去除
提供转染即用型
仅供研究使用。不用于诊断或治疗。