CRISPR系统

Santa Cruz Biotechnology now offers target-specific CRISPR/Cas9 Knockout (KO) Plasmids, CRISPR Double Nickase Plasmids, CRISPR/ dCas9 Activation Plasmids and CRISPR Lenti Activation Systems for over 18,910 human and 18,340 mouse protein encoding genes.

Quick Links

CRISPR/Cas9背景

CRISPR/ CAS系统是一种细菌和古细菌用于外源遗传物质的降解的适应性免疫防御机制。在这些生物体中，来自噬菌体的外源遗传物质获得和整合入CRISPR位点 （1，2）。这种新材料，也称为间隔区，建立用于将来对噬菌体感染性的序列特异性的片段。这些序列特异性的片段 被翻 译成短CRISPR的RNA（crRNAs），其功能为经由CRISPR相关（Cas）蛋白的核酸酶活性，由CRISPR位点编码导向，互补侵入 DNA裂解（1，2）。 II型CRISPR系统Cas9核酸酶具有RNA结合域，α螺旋识别叶（REC），核酸叶，其中包括RuvC和HNH的DNA裂解和 前间区序列邻近基序（PAM）交叉位点（1 ，2）。 crRNA形成与Cas9核酸酶的复合通过结合到REC叶内桥螺旋，并形成多个具有crRNA骨干的盐桥 （1，2，3）。

一旦crRNA结合到Cas9，Cas9核酸酶的构象发生改变，产生一条能通道，让DNA更容易结合。Cas9/crRNA复合体扫描DNA找到PAM (5'-NGG)位点(4,5,6)。识别PAM位点导致DNA解旋，使crRNA找到PAM位点相邻的DNA互补链。当Cas9结合到PAM位点相邻的，与crRNA互补的DNA序列上，REC叶内部的桥螺旋和靶DNA形成RNA-DNA 异源双链结构。PAM位点的识别包括可使靶DNA双链断裂(DSB)的HNH和RuvC核断裂的激活，和导致DNA降解(1,2,5,8)。如果crRNA与靶DNA不互补，Cas9将会释放出来，寻找新的PAM位点(7)。DNA中的线性靶基因组断裂后可以通过非同源末端接合(NHEJ)或者同源介导的修复(HDR)来进行修复。非同源末端接合(NHEJ)会引起插入或者删除错误。同源介导的修复(HDR)可在基因组(2,9,10)的特异性位点结合特定标记。CRISPR/Cas9机制可用于包括哺乳动物细胞在内的各种系统的基因工程中。

采用DSBs进行基因编辑，可以用大范围核酸酶，锌指核酸酶（ZF），或者反式激活因子样的感受器（TALEs）进行，它们可以识别DNA序列，然而，每种方法都有它们的局限性。当使用大范围核酸酶时，难以清楚的显示核酸酶和DNA之间的位点专一识别 (2)。其他选项，ZFs和TALEs，已证明难以设计和识别DNA的3个核苷酸。作用像crRNAs的单个导向RNAs (sgRNAs) 容易设计，还能和Cas9核酸酶在同一载体中一起表达，针对特定DNA位点进行基因编辑。当用于筛选时， CRISPR/Cas 9系统比短发卡RNAs具有更高的敏感性和更高的效率。

使用CRISPR/Cas9系统来减少DSB在基因组DNA的一个重要优势是它的高效。然而这个效率能被一些脱靶效应影响，因此减少CRISPR/Cas9编辑的特异性。特异性能通过使用CRISPR双切口酶系统完善，凭借一对质粒，每一个编码Cas9 (D10A)切口酶突变体(Cas9n)都是通过利用特异的向导RNA来针对明显的基因组DNA特定区域(12)。每个Cas9n/sgRNA复合体仅创造了一个DNA链缺口，是用来让向导RNA补充进来(12)。每对向导RNA被近20个碱基对抵消，并且识别出靶向DNA反义链上的目标序列。一对Cas9n/sgRNA复合体制造了类似于DSB (12)的双切口。因此，成对向导RNA的使用需要考虑到Cas9-调停基因编辑的特异性的增加，同时保持高水平的效率(12)。

除基因组编辑技术之外，CRISPR系统可以被改造成内源基因表达上调的系统(13)。通过修饰CRISPR系统中的一些元件，形成协同激活介质（SAM）复合物，成为一种高效特异地转录激活系统 (13)。SAM复合物中的一个元件是修饰过的Cas9核酸酶。SAM系统中，灭活Cas9的催化域形成dCas9后与转录激活域 （vp64）进行融合。经靶特异向导RNA (sgRNA)引导，dCas9-VP64-sgRNA复合物靶向内源基因转录起始位点（Transcriptional Start Site (TSS)）的-200bp处，上调基因表达(13)。为了进一步提高转录效率，在sgRNA四环和第二个茎环上附加小发夹适配子（minimal hairpin aptamer） 方式修饰sgRNA(13)。经过修饰后，sgRNA上的适配体选择性地与二聚体的MS2噬菌体外壳蛋白结合(13)。 MS2蛋白与p65及HSF1转录激活域融合后形成MS2-P65-HSF1融合蛋白增强转录因子的招募，从而提高dCas9介导的基因活化效率(13)。 激活产品有两种形式，一种是用于转染的标准质粒，还有一种是用于慢病毒包装和转导的慢病毒质粒，它可以高效地将SAM转录激活系统递送到所有的细胞(13)。

Quick Links

CRISPR/Cas9-定向双链断裂 （DSB）

圣克鲁斯生物技术公司所提供的CRISP/Cas9产品

CRISPR/Cas9 质粒

CRISPR/Cas9 Plasmid product details:

  • 20 µg, 最多可用于 20 次转染
  • CRISPR/Cas9 敲除（KO）质粒由三种质粒构成，每个编码Cas9 核酸酶和目标特定的20 nt 导向RNA（gRNA），为最大的敲除效率而设计
  • gRNA 序列来源于 GeCKO (v2)库，指导Cas9蛋白去诱导基因组DNA中的位点专一的双链破裂（DSB）(11)
  • 在产品名称中有（h）或（m），表示有针对人和小鼠基因的CRISPR/Cas9敲除质粒。 例如：p53 CRISPR/Cas9 敲除质粒（h）用于人，或者p53 CRISPR/Cas9敲除质粒（m）用于小鼠
  • 提供纯化转染即用型质粒DNA

Support Products for CRISPR/Cas9 Plasmids:

  • 相应对照抗体可供使用
  • Ultracruz Transfection Reagent, sc-395739
  • Plasmid Transfection Medium, sc-108062
  • Control CRISPR/Cas9 Plasmid, sc-418922
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CRISPR/Cas9如何发挥作用？

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HDR Plasmid

HDR Plasmid description:

  • HDR质粒为DSB提供特异的DNA修复模板，并且仅被用于和CRISPR/Cas9敲除质粒共转染。
  • CRISPR/Cas9与HDR质粒共转染时，Cas9诱导细胞内DNA断裂，HDR质粒结合了嘌呤霉素抗性基因，便于筛选这些细胞。

HDR Plasmid product details:

  • 20 µg, 最多可用于 20 次转染
  • 目标特异性的HDR质粒应用于与优相同靶基因和种属的CRISPR/Cas9 敲除质粒发生同转染
  • HDR Plasmid包含2-3个质粒，每个质粒包含有一个同源定向DNA修复（HDR）模板，与corresponding CRISPR/Cas9 KO Plasmids产生的剪切位点相对应
  • 每个HDR模板包含两个800个碱基对同源臂，可特异地绑定到相应的Cas9诱导的双链DNA破坏位点周围的基因组DNA
  • 每个HDR质粒中嵌入了一个嘌呤霉素抗性基因，从而能筛选出稳定敲除（KO）细胞
  • 在每个嘌呤霉素抗性基因的左右两边各有一个LoxP位点，Cre载体可以进一步处理
  • 每个HDR质粒还含有RFP，用于观察确定转染
  • 提供纯化转染即用型质粒DNA

Support Products for HDR Plasmids:

HDR质粒如何发挥作用？

等位基因的表达

二倍体细胞的染色体是同源成对出现的，其携带的基因也是成对的。这些成对的基因，并不一定完全相同，称之为等位基因。在每个特定的染色体位点，每个基因都拥有两个等位基因。在一个种群中，出现的最频繁的一种等位基因，称为显性野生型等位基因，通常是野生型表现型的原由。突变可产生新的等位基因，而且每种新的等位基因可导致表现型的改变。

由于二倍体细胞的大部分基因含有两个等位基因，因此为了敲除每个目的基因，可能需要额外的转染和筛选，以产生纯合子的基因敲除细胞群。仅使用CRISPR/Cas9敲除质粒将导致NHEJ修复，引起目的基因内部插入和缺失基因。CRISPR/Cas9质粒转染后，在一些细胞中，目的基因的敲除会发生在两个等位基因上（双等位基因敲除），然而有些细胞中，只敲除了一个等位基因（单等位基因敲除）。因此，CRISPR/Cas9转染的细胞种群包含了双等位基因和单等位基因敲除的细胞。

经CRISPR/Cas9敲除质粒转染后，可以进行Western Blot实验，来确定你的细胞群是双等位基因或是单等位基因敲除。通过分离细胞的单细胞克隆，可以培养出只有单等位基因或只有双等位基因的细胞群。一旦这些种群生长至汇合，Western Blot实验可以显示出目的基因的哪个克隆是双等位基因或单等位基因抑制。敲除了双等位基因的细胞群体，Western Blot实验中将显示目的蛋白100%的沉默。然而，只抑制了单等位基因的细胞群体，将显示蛋白表达50%的抑制。

特定的CRISPR/Cas9质粒和同源定向修复（HDR）质粒成功共转染后，将导致基因敲除以及目的基因的同源定向修复（HDR）。共转染之后，可以筛选成功融合了嘌呤霉素抗性基因的细胞。这种筛选下细胞群体中混合了单等位基因敲除的细胞和双等位基因敲除的细胞。Western Blot实验可以进一步确认哪些是双等位基因敲除的细胞克隆。


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Download HDR Protocols

Cre载体

Cre Vector description:

  • Cre载体表达Cre重组酶，这是一种抗菌素酶p1酶，催化2个LoxP位点之间 的位点特异性DNA重组。
  • When the CRISPR/Cas9 Knockout Plasmid is co-transfected with the HDR Plasmid, cells containing the edited DNA can be isolated using the selection marker inserted during homology-directed repair
  • 筛选后，可以用Cre载体转染细胞，切除在同源定向修复中嵌入的遗传物质，例如嘌呤霉素抗性基因

Cre Vector product details:

  • 20 µg, 最多可用于 20 次转染
  • 推荐用CRISPR/Cas9 KO 质粒和 HDR 质粒来进行目标细胞的DNA修复
  • Cre 载体包含一个CMV启动子，以驱使Cre重组酶的表达
  • 提供转染即用型纯化质粒DNA
  • Cre Vector, sc-418923

Support Products for Cre Vector:

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Cre载体如何发挥作用？

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双切口酶质粒

Double Nickase Plasmid product details:

  • 20 µg, 最多可用于 20 次转染
  • Double Nickase Plasmids 含有一对质粒，分别编码D10A 突变的Cas9核酸酶，和目标特异的 20 nt 向导RNA （gRNA），与其相应的CRISPR/Cas9敲除质粒相比，它在基因敲除方面具有更高的特异性
  • 成对的向导RNA序列被将近20个碱基对抵消了，考虑到基因组DNA特异的Cas9调停双切口，类似于DSB位点
  • 一个质粒对包含了一个供筛选使用的嘌呤霉素抗性基因；其他质粒对包含了供观察转染使用的绿色荧光蛋白标记
  • 双切口酶质粒可用于人或小鼠基因，在产品名称中用（h）或（m）表示。 例如： p53 双切口酶质粒（h） 用于人，或者 p53 双切口酶质粒（m） 用于小鼠
  • 提供纯化转染即用型质粒DNA

Support Products for Double Nickase Plasmids:

  • 相应对照抗体可供使用
  • Ultracruz Transfection Reagent, sc-395739
  • Plasmid Transfection Medium, sc-108062
  • Control Double Nickase Plasmid, sc-437281
  • Puromycin dihydrochloride, sc-108071
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双切口酶质粒如何发挥作用？

Download Double Nickase Protocols

激活质粒

CRISPR/dCas9 Activation Plasmid product details:

  • 20 µg, 最多可用于 20 次转染
  • CRISPR/dCas9激活质粒是一种协同激活介质（SAM）转录激活系统，目的在于特定上调基因表达
  • CRISPR/dCas9激活质粒包含以下三种质量比为1:1:1的质粒：一种质粒编码去活化的Cas9 (dCas9)核酸酶(D10A and H840A)，它融合了转录活化域VP64；一种质粒编码MS2-p65-HSF1融合蛋白；一种质粒编码目标特定的20 nt向导RNA
  • gRNA序列来自CRISPR/Cas9协同激活介质（SAM）汇集的人类文库，指导SAM复合物结合到目标基因的转录起始位点上游大约200-250 nt的特定位点区域
  • SAM系统为高效激活目的基因提供转录因子的招募
  • 在产品名称中有（h）或（m），表示有针对人和小鼠基因的CRISPR/dCas9激活质粒。 例如： p53 CRISPR/dCas9激活质粒（h）用于人，或者 p53 CRISPR/dCas9激活质粒（m） 用于小鼠
  • 提供纯化转染即用型质粒DNA

Support Products for CRISPR Activation Plasmids:

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激活质粒如何工作？

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慢病毒激活颗粒

CRISPR/dCas9 Lentiviral Activation Particles product details:

  • 慢病毒激活质粒编码一个协同激活介质（SAM）转录激活系统，通过细胞的慢病毒转导，特异且高效地上调基因表达(13)
  • SAM复合物结合到转录起始位点上游大约200-250 nt的特定位点区域，为高效激活基因，招募转录因子
  • 慢病毒激活粒子是通过使用25 mM HEPES pH 7.3的Dulbecco's Modified Eagle介质的200 µl 冷冻状态，包含了3个CRISPR/dCas9激活质粒的关键因素，是目的基因上调的必须因素:
    1. 去活化的Cas9 (dCas9)核酸酶(D10A and N863A)熔解来反式激活VP64区和杀稻瘟菌素抗性基因
    2. MS2-p65-HSF1 fusion protein, and hygromycin resistance genes
    3. 目标特异基因20 nt。向导RNA和嘌呤霉素抗性基因
  • 推荐使用于难转染的细胞
  • CRISPR/dCas9慢病毒激活质粒可用于人和小鼠的基因，在产品名称中分别用（h）或（m）表示。例如：p53 慢病毒激活质粒（h）用于人，或者p53 慢病毒激活质粒（m）用于小鼠

Support Products for CRISPR Lentiviral Activation Particles:

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慢病毒激活颗粒如何工作？

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常见问题

  • 相比于RNAi产品，CRISPR/Cas9系统的优势是什么？

    CRISPR/ Cas9系统敲除目的蛋白靶向并且编辑基因组DNA，而不是使用RNA干扰，降解mRNA。一旦基因组DNA被编辑，该变化是永久的。

  • 为什么研究者相比于ZFNs 和 TALENs，更倾向于使用CRISPR/Cas9 基因组编辑工具？

    CRISPR/Cas9系统价格低廉，效率更高并且灵敏度高。

  • gRNA序列是怎么设计出来的？

    圣克鲁斯生物技术使用具有三条不同序列的gRNA，文献参考GeCKO v2 library。发布的序列被证明具有很高的修饰效率及低的脱靶率。

  • 是否提供gRNA序列？

    是的，我们可以向客户提供这些序列。如有需要，请联系我们的技术支持。

  • 为什么CRISPR/Cas9 KO 质粒要设计成包含三条不同的目标RNA序列？

    我们设计我们的 CRISPR/Cas9 KO 质粒包含3条不同的gRNA序列，是为了保证充分的基因干扰。

  • HDR质粒包含三条序列吗？

    是的，每个HDR质粒都设计为能与它相对应的gRNA配套使用。

  • CRISPR/Cas9 KO质粒能否单独使用用来敲除基因？

    是的，但是这将导致非同源末端连接（NHEJ），这可能导致个InDel（插入/缺失）。InDel改变开放阅读框（ORF）和下游的双链断裂（DSB），可以显著改的氨基酸序列或引入一个提前终止密码子。通过NHEJ创建个InDel可能导致随机突变，所以该类型和基因破坏的程度需要通过实验确定。

  • 我怎样判断我的细胞样本已用CRISPR/Cas9 KO质粒成功转染？

    细胞将会进行GFP的表达测定，用来检测转染效率。进一步的测定是必要的，以确定基因敲除的程度。

  • 我怎样判断我的细胞样本已用HDR质粒成功转染？

    细胞将会进行RFP的表达测定，用来检测转染效率。进一步的测定是必要的，以确定基因敲除的程度。

  • 我怎样判断用CRISPR/Cas9 KO质粒和HDR质粒成功的进行了基因编辑？

    成功编辑的细胞将会在基因组DNA中包含一个嘌呤霉素抗性基因，可以使用嘌呤霉素筛选。

  • HDR质粒中的左同源臂和右同源臂长度是多少？

    他们具有长度为800的碱基对，以确保与基因组DNA以及同源性定向修复正确配合。

  • 是否提供CRISPR对照产品？

    我们体统一个阴性对照，是一个具有单条乱序gRNA 的CRISPR/Cas9 KO质粒，产品名称为对照CRISPR/Cas9质粒，sc-418922。这条乱序的gRNA 不会结合基因组靶向DNA ，并且Cas9/gRNA组合也不会结合或者生成DSB。

  • 什么是PAM序列？

    该protospacer相邻基元（PAM）的序列必须是存在于DNA靶序列的3'端，但不存在于gRNA序列。为了Cas9成功与DNA结合，在基因组DNA靶序列必须是互补的导向RNA序列，它必须紧跟在3'端的PAM序列。

  • Cas9/gRNA在哪里切断基因组DNA？

    Cas9将切断基因组DNA靶序列的3'末端的下游大约3-5个碱基对。

  • CRIPSPR/ Cas9系统是否能在分裂和未分裂的细胞上正常工作？

    是的。正在分裂的细胞可选择使用NHEJ或HDR途径；而未分裂的细胞只能使用NHEJ途径。

  • 针对不同的细胞系，敲除效率是否有所不同？

    是的，对于不同的细胞系和靶序列，结果会出现差异。

  • 怎样判断目的基因是否成功被CRISPR/Cas9 系统敲除？

    验证基因沉默有几种不同的方式。嘌呤霉素将筛选已经成功被HDR质粒编辑过的细胞。WB分析可以说明基因沉默。基因组PCR可以检测基因组整合。突变可以通过扩增的基因组序列，克隆的PCR片段，之后测序来进行检测。

  • 你们有什么建议的Western blot和/或免疫荧光转染的验证？

    WB和IF可以确定Cas9蛋白的表达。也可以使用RFP标记物在显微镜下观察荧光或者使用Cas9 抗体，我们目前正在生产Cas9 抗体。

  • 一次可以同时敲除多少个基因？

    我们还没有验证能够一次敲除的最大基因量。研究表明可以一次敲除几种基因，这个决定于在共转染中细胞的状态。我们推荐并且质保一次只一个使用CRISPR/Cas9 KO质粒。

  • 哪些相关试剂和转染试剂我必须从SCBT购买以用于你们的 CRISPR/Cas9 KO 质粒？

    Control CRISPR/Cas9 Plasmid sc-418922, Ultracruz Transfection Reagent sc-395739, Plasmid Transfection Medium sc-108062, Puromycin dihydrocholoride sc-108071. We also offer control antibodies for each target-specific CRISPR/Cas9 KO Plasmid.

  • 我们是否提供CRISPR产品定制服务？

    请联系我们的技术支持。

  • 如果CRISPR暂时没有库存，货期大约为多久？

    请联系技术服务以获取特定于产品的ETA信息。

References

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