fumarate hydratase CRISPR/Cas9 KO质粒 (m): sc-420348
- 针对种属：mouse
- 20 µg 纯化的即用型的质粒DNA，最多可供20次转染
- fumarate hydratase CRISPR/Cas9 基因敲除（KO）质粒（m） 是一组质粒混合物，每种质粒均编码 Cas9 核酸酶及针对特定靶点的 20 核苷酸引导 RNA（gRNA），其设计基于 GeCKO v2 文库中的序列，旨在实现最高的基因敲除效率
- gRNA序列引导Cas9在fumarate hydratase基因组位点诱导位点特异性双链断裂（DSBs），从而通过非同源末端连接（NHEJ）实现基因敲除
- 建议将 fumarate hydratase HDR 质粒 (m) (sc-420348-HDR) 与 fumarate hydratase CRISPR/Cas9 KO 质粒 (m) 共同转染，通过 HDR 介导的嘌呤霉素抗性 cassete 和 RFP 报告基因整合，实现对成功编辑细胞的筛选
- fumarate hydratase HDR质粒（m）是一组质粒混合物，其中每条质粒均含有一个同源导向修复（HDR）模板，对应于fumarate hydratase CRISPR/Cas9 KO质粒（m）中的gRNA靶位点
- 每个HDR质粒包含两个约800 bp的同源臂，分别位于嘌呤霉素抗性基因和RFP基因片段的两侧，其设计目的是结合Cas9诱导的双链断裂位点周围的基因组DNA序列，从而促进精确的HDR介导整合
- 嘌呤霉素抗性基因和 RFP 基因两侧有 LoxP 位点，因此在建立稳定的基因敲除细胞系后，可以通过 Cre 重组酶（Cre 向量：sc-418923）去除选择标记。
- 转染后，基因敲除效率可以用抗体：fumarate hydratase: sc-393992，通过WB, IF或者IHC分析
订购信息
| 产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格 | 数量 | 收藏夹 | |
fumarate hydratase CRISPR/Cas9 KO质粒 (m) | sc-420348 | 20 µg | CNY2986.00 | |||
fumarate hydratase HDR 质粒 (m) | sc-420348-HDR | 20 µg | CNY3347.00 |
概述
小鼠 Fh1 编码延胡索酸水合酶（fumarate hydratase，FH），这是一种在三羧酸（TCA）循环中高度保守的线粒体酶，催化延胡索酸可逆水合生成 L-苹果酸，从而支持氧化代谢与补给通量（anaplerotic flux）。通过调控延胡索酸水平，FH 影响氧化还原平衡和线粒体功能，并可影响与代谢物累积相关的信号应答，包括与假性缺氧（pseudohypoxia）相关的转录程序以及表观遗传酶活性。FH 活性受损与能量代谢改变、作为致癌代谢物（oncometabolite）的延胡索酸升高，以及对细胞应激反应和分化状态的广泛影响相关。因此，Fh1 是研究代谢重编程、线粒体质量控制，以及哺乳动物体系中 HIF 信号、ROS 处理与染色质调控等下游通路的一个有用节点。
fumarate hydratase CRISPR/Cas9 敲除质粒（m）是一组质粒池，旨在针对性地破坏mouse细胞系中的Fh1基因。该文库中的每个质粒均共表达一种独特的sgRNA，针对Fh1基因座内的不同位点，同时表达来自化脓性链球菌的Cas9核酸酶，并编码GFP以实现对成功转染细胞的荧光识别和富集。这种多引导策略提高了诱导产生功能性敲除的移码突变或缺失的概率，为单引导策略提供了更可靠的替代方案。在多个位点诱导的双链断裂（DSBs）可通过非同源末端连接（NHEJ）修复，或者当与随附的HDR供体模板配合使用时，可在基因座内的特定靶位点通过同源导向修复（HDR）进行修复。
若与表达 RFP 的 HDR 供体结合使用，可同时利用 GFP 和 RFP 荧光区分转染细胞群与编辑后的细胞群，从而简化基于流式细胞术的分选和克隆筛选工作流程。
同源导向修复 (HDR) 供体 — 含 RFP 报告基因的嘌呤霉素抗性 cassete
对于需要确认且可筛选的敲除克隆的应用，fumarate hydratase HDR质粒（m）包含一个HDR供体构建体，其中含有嘧啶霉素抗性盒（PuroR）和红色荧光蛋白（RFP）报告基因，两侧由针对特定Fh1靶位点的同源臂包围。
与 fumarate hydratase CRISPR/Cas9 敲除质粒（m）共转染时：
- PuroR-RFP 片段通过同源重组（HDR）整合到 Cas9 切割位点，从而破坏 Fh1 的开放阅读框。
RFP 荧光可作为整合成功的即时视觉指示，支持在嘌呤霉素筛选之前或同时，基于荧光对编辑后的细胞进行鉴定或分选。
通过嘌呤霉素抗性可确认编辑成功的细胞，从而大幅减轻克隆筛选的工作量。
该筛选策略非常适合构建稳定的克隆性敲除细胞系，用于下游的功能研究、药物筛选或模型开发。
Cre-lox 盒去除系统
HDR 供体构建体的loxP 位点位于 PuroR-RFP 选择盒的侧翼，可在克隆确认后干净利落地去除标记。通过随附的Cre 载体：sc-418923，瞬时表达 Cre 重组酶，切除基因盒，在Fh1 基因座内留下最小的残留 loxP 位点，消除对下游检测的潜在干扰效应。
这种两步法
- 最大限度减少对局部染色质结构及邻近调控元件的干扰
在编辑位点恢复近乎天然的基因组环境
支持在同一细胞系中重复使用嘌呤霉素筛选策略进行后续编辑
主要特点
- gRNA靶向对fumarate hydratase功能至关重要的Fh1外显子
SpCas9与sgRNA由单一质粒共表达，简化递送流程
含嘌呤霉素抗性的HDR供体，便于阳性克隆筛选
由Cre重组酶载体携带的loxP夹杂PuroR盒，实现无缝标记去除
提供转染即用型
仅供研究使用。不用于诊断或治疗。