AFMIDCRISPR激活质粒(h): sc-414235-ACT

人类 AFMID（芳基甲酰胺酶）在色氨酸分解代谢通路中催化 N-甲酰犬尿氨酸水解生成犬尿氨酸，从而支持犬尿氨酸—NAD⁺ 生物合成轴的代谢通量。通过塑造细胞内犬尿氨酸及其下游代谢物的水平，AFMID 会影响氧化还原稳态，以及与线粒体功能和细胞应激反应相耦联的代谢信号程序。色氨酸代谢失衡和犬尿氨酸通路活性改变与多种疾病背景下观察到的免疫调节和代谢重塑有关，因此 AFMID 是开展通路调控机制研究的一个有用节点。由此，AFMID 的表达与活性对于研究营养物质利用如何与炎症相关信号及细胞适应相交汇具有重要意义。

AFMID CRISPR激活质粒（h）提供了一种靶向、非破坏性的方法，可在不改变底层DNA序列的情况下上调内源性AFMID的表达。

AFMID CRISPR激活质粒（h）是一个由三条质粒组成的协同激活介导（SAM）系统，旨在对人类细胞系中的AFMID基因座进行高效、位点特异性的转录上调。该系统以一种携带两个失活突变（D10A 和 N863A）的无催化活性的 Cas9（dCas9）为核心，这些突变消除了核酸酶活性，同时保留了 DNA 结合能力。该 dCas9 与强效转录激活因子 VP64 融合，并与用于筛选的布拉西定抗性基因共同表达。第二个质粒编码MS2-p65-HSF1融合蛋白——这一二级激活复合物与dCas9-VP64协同作用，并携带潮霉素抗性基因。第三个质粒编码靶标特异性20 nt sgRNA，其与两个MS2 RNA适配体融合，这些适配体可将MS2-p65-HSF1复合物招募至激活位点，并携带嘌呤霉素抗性基因。这三个质粒按1:1:1的质量比递送，以确保系统所有组分的平衡表达。

在靶位点组装完成后，SAM复合物结合于AFMID转录起始位点上游约200 bp处，VP64、p65和HSF1在此协同作用，招募转录 machinery并驱动内源性AFMID表达上调。与具有核酸酶活性的Cas9不同， dCas9不会引入双链断裂或修改基因组序列，从而保留了原生的AFMID位点，并能够研究内源性位点上依赖于AFMID的转录反应，使其成为功能研究、靶基因鉴定以及在AFMID表达被沉默或降低的肿瘤细胞中模拟AFMID通路恢复的宝贵工具。

仅供研究使用。不用于诊断或治疗。